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L-酪氨酸的常见生产方法

时间:2021-08-24点击次数:111信息来源:Rev1

L-酪氨酸的常见生产方法

L-酪氨酸早期的生产主要依靠蛋白质水解法。但是蛋白质水解法存在着材料来源有限、工艺与产品复杂、周期长等缺点,因而已经被淘汰。L-酪氨酸主要由酶法、微生物发酵法、提取法和化学法等四种方法来生产。

酶法

酶法也称为微生物转化法,主要是利用微生物细胞内酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase,TPL,EC 4.1.99.2)将苯酚、丙酮酸和氨或者苯酚、L-丝氨酸转化为 L-酪氨酸。研究较多的、具有较高酶活的 TPL 主要来自于微生物草生欧文氏菌(Erwinia herbicola) 、中间柠檬酸菌( Citrobacter intermedius) 、弗氏柠檬酸菌( Citrobacter freundii) 以及嗜热菌( Symbiobacterium toebii) 等。Genex 公司的 Lee 和 Hsiao于 1986 年较早利用产气克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes) 丝氨酸羟甲基转移酶和 Erwinia herbicola ATCC 21434 酪氨酸酚裂解酶,将以甘氨酸为底物合成 L-丝氨酸的反应和以 L-丝氨酸为底物合成 L-酪氨酸的反应相偶联。在 500mL 反应体系中加入 0.32%苯酚、0.25 M 甘氨酸、0.5 mM 5-磷酸吡哆醛、0.056Mβ-巯基乙醇、1.7mM 四氢叶酸。在 pH 为 7.0、37℃条件下以 37%甲醛启动反应,16 h 后可产生 L-酪氨酸 26.3 g /L,甘氨酸转化率达到61.4%。但该工艺稳定性较差而且甘氨酸对 TPL 活性有很强的抑制作用。考虑反应过程中酶活性和稳定性差等缺点,近年来利用 DNA 改组技术提高TPL 稳定性也受到关注。韩国 KRIBB 的 Eugene 等人通过对 Symbiobacteriumtoebii 中的 TPL 进行随机突变筛选和交错延伸 DNA shuffling 得到了催化活性提高三倍,同时半失活温度提高了 11.2℃的 AS6 突变体。测序结果显示在催化活性区域其存在 T129I 或者 T451A 突变,而包含 A13V, E83K 和 T407A 在内的三个突变则对提高热稳定性有极大帮助。而此课题组的 Kim 等人在 E. coliBL21(DE3)中过表达此催化活性和热稳定提高的 TPL,并制备成催化粗提液。在2.5 L 的流加式反应器系统中通过分批补加 2.2 M 的苯酚、2.4M 的丙酮酸钠、0.4 mM 5-磷酸吡哆醛和 4 M 的氯化铵并在反应罐上方充满氮气以降低底物的氧化作用, 40℃反应 30 h 后可积累 130 g/L 的 L-酪氨酸,苯酚的转化率较高可达 94%。

微生物发酵法

微生物发酵法通常以甘油、葡萄糖等生物质碳源为原料,通过优良的微生物菌种在合适的条件下发酵来累积 L-酪氨酸。早期研究常通过人工诱变来选育 L-酪氨酸高产菌株,如筛选 L-苯丙氨酸或 L-色氨酸缺陷或抗反馈抑制的菌株等。然而大多数微生物积累芳香氨基酸的能力很低,且其代谢途径的调控机制十分复杂,传统的诱变育种方法往往只能对局部代谢途径或者关键酶作用,难以对全局的 L-酪氨酸代谢流造成很大的影响。近年来随着代谢工程和各种先进生物技术的迅猛发展,重新合理设计微生物的代谢途径来更好地实现 L-酪氨酸的发酵生产逐渐成为研究热点。研究较多的 L-酪氨酸代谢工程菌主要有大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。其中以大肠杆菌和谷氨酸帮杆菌中 L-酪氨酸的合成途径和调控机制研究的较多并阐释的较为清楚。
L-酪氨酸生物合成途径属于芳香族氨基酸合成途径。其合成的前体物 4-磷酸赤藓糖(Erythrose-4-phosphate, E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenol pyruvate, PEP)在 DAHP 合成酶(DS)的催化下缩合生成 3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP),该反应也是 L-酪氨酸生物合成途径的*个限速步骤。在大肠杆菌中 DAHP 合成酶包含 AroG、AroF 和 AroH 三个同工酶,其表达和酶活分别受产物 L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和 L-色氨酸的反馈阻遏和反馈抑制。从 DAHP 到分支酸的 7 步反应对于所有芳香氨基酸是共同途径。而分支酸是芳香族氨基酸合成途径的分支点,一个分支途径用于合成 L-色氨酸,另一部分则在分支酸变位酶(Chorism mutase, CM)和预苯酸脱水酶(Prephenatedehydratase, PD)双功能酶 TyrA 的作用下生成对羟基苯丙酮酸(4HPP),后者通过与 L-谷氨酸的转氨作用生成 L-酪氨酸,而 TyrA 的表达和酶活同样受到产物L-酪氨酸的反馈阻遏和反馈抑制。

提取法

提取法在1820年首先由Braconnot发明,他将甘氨酸和亮氨酸从明胶羊色和肌肉水解液中提取得到,那之后,Bopp等人义逐渐在蛋白质中将酪氨酸和丝氨酸水解出来。较古老的氨基酸生产的工芝,即进白质水解提取法。蛋白质可W进行酶、酸或巧的水解,其产物较终为氨基酸。常用6M盐酸在110°C水解进行12—24h,去掉多余的酸后,提取出各种氨基酸的混合物。较后使用溶度差法或离子交换树脂的方法提取,得到相对纯度的氨基酸至20世纪
三四十年代,使用提取法己经可以获得20多种氨基酸,较著名的氨基酸产业就是味精,发展到今天,虽然氨基酸大部分都可从各种资源中提取,但由于资源成本高、低收率、污染环境等方面原因,并不适合继续大规模生产。提取法生产心酪氨酸,一般是利用天然蛋白资源为原料,将其进行水解、浓缩、结晶、脱色等步骤的处理,分离提取心酪氨酸。但因为提取所得产品中L-酪氨度的含量较低,实际上提取法的收率较低,所以并不适合大规模生产。

化学合成法

虽然19世纪化学合成法就己经开始用来合成氨基酸,但直到本世纪50年代才将化学法合成氨基酸,这种方法是利用有机合成和化学工程结合的技术,生产氨基酸。其较大的优势是不受氨基酸品种上限制,在制备天然気基酸外,还可生产非天然安基酸,包括一些非常特殊结构的氨基酸,并且可以大规模生产。但化学方法也有缺点,主要问题是工艺较复杂,只能合成氨基酸的D、L-型外消旋体,只有经过了光学拆分,才可获得具有光学活性的氨基酸。至今,多种氨基酸仍用化学合成法生产,特别是在饲料中用量很大的D、L-蛋氨酸,生产方法仅有化学合成法,其产量约为几十万吨/年。另外,药用和食用甘氨酸,其大规模的生产方法也是采用化学合成法。

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L-酪氨酸

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